En 1999 Ana Pastor comenzó a trabajar para la Cadena SER. Allí formó parte del equipo de Iñaki Gabilondo y se especializó en información internacional. Ha sido enviada especial en el desastre del tsunami del sudeste asiático y los atentados del 7-J de Londres, y ha cubierto informaciones en Pakistán, Afganistán, Níger, Senegal, Guinea Ecuatorial, Gambia, Liberia y Sierra Leona.
Además, dirigió y presentó el programa semanal de actualidad Punto de fuga, donde entrevistó a gente como Ellen Johnson-Sirleaf, presidenta de Liberia o la expresidenta de Irlanda y premio Príncipe de Asturias Mary Robinson.
En septiembre de 2006 fue fichada para presentar el programa de TVE 59 segundos, en el que los participantes tienen un minuto para exponer su postura sobre la actualidad política.
Desde septiembre de 2009 hasta 2012 presentó el espacio Los desayunos de TVE en sustitución de Pepa Bueno. Este espacio consiguió una gran aceptación entre el público, consiguiendo ser líder de su franja horaria en octubre de 2010. La salida de Ana Pastor en 2012 supuso un descenso paulatino de la audiencia del programa, y hasta hoy no se han podido superar los datos de audiencia de la «era Pastor». Otras colaboraciones incluyen la presentación de Informe Semanal junto con otros periodistas de la empresa, y la participación en el programa vespertino Asuntos Propios de RNE, presentado por Toni Garrido.
El 15 de marzo de 2011 realizó una entrevista al presidente iraní Mahmud Ahmadineyad, que originó un gran interés, y que estuvo también acompañada de cierta polémica ya que el velo que cubría a la periodista resbaló sobre sus hombros, por lo que su pelo quedó al descubierto durante el resto de la entrevista. Por dicha entrevista, su nombre causó gran revuelo en internet y en las redes sociales. Igualmente célebre fue su réplica al presidente de Ecuador, Rafael Correa.
En esa misma entrevista, frente a un Rafael Correa que declaraba la parcialidad de la prensa en pro de intereses políticos y económicos Ana Pastor argumentó que la prensa servía de «intermediaria» entre los ciudadanos y los gobiernos y que, salvo excepciones, los medios de comunicación eran profesionales.
El 12 de agosto de 2011 el portavoz del Partido Popular arremete contra la periodista, insinuando la posibilidad de despedirla si el Partido Popular ganara las elecciones por realizar, según su criterio, un trabajo sesgado y no ser imparcial. Pocos meses antes la periodista había realizado una entrevista a la secretaria general de dicha formación política, María Dolores de Cospedal, envuelta en la polémica, por la cerrada defensa de la periodista de la neutralidad y objetividad de la cadena, cuestionada por Cospedal. A partir de estas declaraciones se genera una gran polémica, ya que la periodista ha sido galardonada con varios premios nacionales por su imparcialidad, como el «Premio Libertad de Expresión 2011» entregado por la Asociación de Prensa Nacional,17 candidata al VII Premio Couso de libertad de prensa y Premio Triángulo 2011.
Tras el triunfo del PP en las elecciones de noviembre de 2011, este renueva la directiva de RTVE, tomando Leopoldo González-Echenique el cargo de presidente de RTVE y Julio Somoano el de director de informativos de TVE. Debido a esto, el 4 de agosto de 2012, se hizo público su cese de la dirección del programa Los desayunos de TVE. Desde RTVE argumentaron que le habían ofrecido otro programa que ella rechazó; sin embargo, la periodista desmintió tal propuesta y declaró que la echaron «por hacer periodismo», y que no le ofrecieron nada concreto.
En septiembre de 2012, se hizo público su fichaje por CNN en Español para presentar un programa de entrevistas a personalidades de la política, la cultura y el deporte a nivel nacional e internacional que serán emitidas por los canales de CNN Internacional y CNN en Español.En su programa Frente a frente ha entrevistado a personalidades de prestigio como Antonio Banderas, Ferran Adrià, Juan Manuel Santos, Rafael Correa o Rafa Nadal. En España, las entrevistas son emitidas por el canal de cable TNT (España).
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